Optimalisering av reaksjonsbetingelser for å oppnå et høyt utbytte av stevia rebaudiosid d
Sukkerrike dietter har ført til en økende forekomst av ulike kroniske sykdommer, inkludert fedme, diabetes, hjerte- og karsykdommer og høyt blodtrykk, noe som utgjør en betydelig global folkehelseutfordring. Stevia Rebaudioside D (Reb D), et naturlig søtningsmiddel utvunnet fra planter, har fått betydelig oppmerksomhet som sukkererstatning på grunn av sitt kalorifrie innhold, intense sødme og behagelige smaksprofil.
Imidlertid har dens begrensede tilstedeværelse i stevia rebaudiana Bertoni og utfordringer knyttet til lav løselighet og enzymatisk aktivitet av plantebasert glykosyltransferase hindret dens utbredte kommersielle bruk. Som svar på disse problemene ble en ny glykosyltransferase kalt YojK, som stammer fra Bacillus subtilis 168, oppdaget. Denne studien introduserer en genetisk modifisert bakteriell glykosyltransferase, YojK-I241T/G327N, kjennetegnet ved høy løselighet og katalytisk effektivitet, noe som gir stort potensial for industriell produksjon av Reb D.
Utviklingen av en svært effektiv metode for produksjon av rebaudiosid D ved bruk av en kaskadereaksjon av YojK-I241T/G327N og AtSuSy-enzymer.
To address the issue of low solubility in plant-derived glycosyltransferases, researchers investigated the potential of using YojK, an O-glycosyltransferase from Bacillus subtilis 168. YojK was chosen because of its demonstrated glycosylation activity with various substrates, including large molecules. After successful recombinant expression and purification, YojK was employed to glycosylate Reb A, resulting in the production of Stevia Reb D. Enzyme kinetic analysis revealed that YojK has lower catalytic activity toward Reb D compared to other glycosyltransferases. Consequently, the study suggests the necessity for structure-guided engineering to enhance YojK's catalytic activity for potential practical applications. (as shown in Figur 1)
Figur 1
Optimalisering av reaksjonsbetingelser for å oppnå et høyt utbytte av rebaudiosid D.
The reaction conditions, including pH, temperature, and substrate concentration, can be optimized to achieve a high yield of Srevia Reb D. The study used molecular dynamics simulations to investigate how the YojK-I241T/G327N variant enhances Reb D glycosylation. The variant maintained a stable hydrogen bond between Reb A and H14 during simulations, unlike the wild-type(as shown in Figur 2). This stability also extended to the distance between Reb A's O2 atom and UDPG's C1P. The YojK-I241T/G327N variant's improved catalytic efficiency was attributed to these stable interactions, suggesting its practical potential.
Figur 2
Figur 3
Konklusjon
Denne tilnærmingen ga 83,47 % Reb D. Merkbart var det å legge til 1 mM UDPG som muliggjorde syntese av 20,59 g/L Reb D med et bemerkelsesverdig utbytte på 91,29 %, noe som overgikk tidligere studier. Denne prosessen demonstrerer potensialet for industriell produksjon av Reb D, spesielt etter strukturell ingeniørkunst av YojK.YojK kan effektivt uttrykkes i E. coli BL21 (DE3) med høy løselighet. Gjennom strukturstyrt ingeniørkunst ble en dobbel mutant, YojK-I241T/G327N, skapt, noe som muliggjorde storskalaproduksjon av Reb D med et eksepsjonelt utbytte på 91,29 % ved å resirkulere UDPG katalysert av sukrosesyntasen AtSuSy. Denne studien presenterer YojK-I241T/G327N som et lovende verktøy for økonomisk effektiv industriell produksjon av Reb D.
