Kvantifisering av NAD+ og dets metabolitter i muse-isjiasnerver
Introduksjon
De avgjørende delene av nikotinamidadenin-dinukleotid (NAD+) og dets metabolitter i aldring og nevrodegenerasjon er bredt anerkjent. For å fremme fremgang mot biokjemisk forskning og intervensjoner rettet mot aldrings- og nevrodegenerative sykdommer, er det av stor betydning å nøyaktig kvantifisere NAD+ og dets metabolittnivåer i NAD+ salvage-veien. Her brukes en robust og nøyaktig LC-MS/MS-metode for å kvantifisere NAD+ og metabolittnivåene i normal og skadet muse-isjiasnerve.Begrensninger ved eksisterende metoder for å kvantifisere NAD+ og dets metabolitter
Tradisjonelle metoder for å kvantifisere NAD+ og dets metabolitter, som HPLC-UV, NMR, kapillærssoneelektroforese eller kolorimetriske enzymatiske analyser, møter ulike utfordringer innen sensitivitet, selektivitet og indirekte målinger. Når det gjelder eksisterende LC-MS/MS-tester for cellulære eller vevsmålinger av NAD+ og dets metabolitter, er det fortsatt mange utfordringer å overvinne, som forlenget kjøretid, dårlig kromatografisk retensjonsatferd og utilfredsstillende toppformer. Dessuten kan bare én til tre stoffer i NAD+ bergingsveien dekkes med disse metodene.Modifikasjonene av LC-MS/MS-metoden
On the basis of existing LC-MS/MS assays, the modifications regarding the chromatographic conditions, surrogate matrix and MS/MS conditions are conducted. Specifically, 5 μM of methylene phosphonic acid is employed as the mobile phase additive, which explicitly promotes the signal intensity and peak shape. Given the relatively clean and simple nature of never samples and their small size, ultrapure water is tested as a substitute matrix. Instead of hydrophilic interaction liquid chromatography column and hypercarb column, the Waters Atlantis Premier BEH C18 AX column is utilized, whose unique MaxPeak HPS high-performance surface technology (passivating the column inner wall, eliminating metal surface) enables the high reproducibility, peak symmetry, and baseline separation of all analytes. I tillegg er MS-forholdene optimalisert for å minimere NAD+-interferenssignalet i den sykliske adenosindifosfat ribose (cADPR)-kanalen, samtidig som responsen til cADPR og nikotinamidmononukleotid (NMN) opprettholdes, med 4000V for ionesprayspenning, 450°C for turbovarmertemperatur, 50 psi for Gass 1, 50 psi for Gass 2, 30 psi for gardingass og 12 psi for kollisjonsgass.
Representativt kromatogram av nerveprøver (normale vs skadede)
Alle de fem analyttene oppnår baseline-separasjon, der cADPR er en sensitiv biomarkør i nevrodegenerasjonsmodellen. Her induserer isjiasnervens axotomi aksonal degenerasjon, noe som fører til redusert NAD+-nivå og forhøyet NMN-nivå i de skadde nervene, noe som gir omtrent to ganger økning i NMN/NAD+-forholdet. Samtidig reduseres nivåene av nikotinamid (NAM) og adenosindifosfatribose (ADPR) med omtrent 2 ganger, mens cADPR-nivået øker med mer enn 8 ganger. Disse resultatene er i samsvar med tidligere rapporterte resultater, og verifiserer nøyaktigheten til denne modifiserte LS-MS/MS-metoden i kvantifisering av NAD+ og dets metabolitter.
Konklusjon
Denne modifiserte LC-MS/MS-metoden muliggjør effektiv baseline-separasjon av NAD+, NMN, NAM, ADPR og cADPR innen en kort kjøretid på 5 minutter, noe som bidrar til tidlige diagnoser av ulike nevrologiske lidelser og legemiddelutvikling for aldrings- og nevrodegenerative sykdommer.Referanse
Ma Y, Deng L, Du Z. Utvikling og validering av en LC-MS/MS-metode for kvantifisering av NAD+ og relaterte metabolitter i musenes isjiasnerver og dens anvendelse på en dyremodell for nerveskade. J Chromatogr A. doi:10.1016/j.chroma.2024.464821BONTAC NAD
BONTAC har siden 2012 vært dedikert til forskning og utvikling, produksjon og salg av råvarer for koenzymer og naturlige produkter, med egeneide fabrikker, over 170 globale patenter samt et sterkt FoU-team. BONTAC har rik erfaring innen forskning og utvikling og avansert teknologi innen biosyntese av NAD og dets forløpere (f.eks. NMN og NR). Det finnes ulike typer NAD som skal velges, inkludert NAD ER-grad (endoksinfjerning), NAD grad I (IVD/kosttilskudd/kosmetikkråpulver), NAD grad II (API/mellomprodukter) og NAD grad IV (hvis det er høyere krav til løselighet), som kan tilbys i form av lyofilisert pulver eller krystallinsk pulver. Renheten til BONTAC NAD kan nå over 98 %.
