Kvantifisering av NAD+ og dets metabolitter i musens isjiasnerver
Introduksjon
De viktigste delene av nikotinamidadenindinukleotid (NAD+) og dets metabolitter i aldring og nevrodegenerasjon er blitt bredt anerkjent. For å fremme fremgang mot biokjemisk forskning og intervensjoner rettet mot aldring og nevrodegenerative sykdommer, er det av stor betydning å nøyaktig kvantifisere NAD+ og dets metabolittnivåer i NAD+-redningsveien. Her anvendes en robust og nøyaktig LC-MS/MS-metode for å kvantifisere NAD+ og dets metabolittnivåer i normal og skadet mus-isjiasnerv.Begrensninger ved eksisterende metoder for kvantifisering av NAD+ og dets metabolitter
Tradisjonelle metoder for kvantifisering av NAD+ og dets metabolitter, som HPLC-UV, NMR, kapillærsoneelektroforese eller kolorimetriske enzymatiske analyser, møter ulike utfordringer når det gjelder følsomhet, selektivitet og indirekte måling. Når det gjelder eksisterende LC-MS/MS-analyser for cellulære eller vevs-NAD+ og dets metabolittmålinger, er det fortsatt mange vanskeligheter å overvinne, som utvidede kjøretider, dårlig kromatografisk retensjonsatferd og utilfredsstillende toppformer. Dessuten kan bare én til tre stoffer i NAD+-redningsveien dekkes av disse metodene.Modifikasjonene av LC-MS/MS-metoden
På grunnlag av eksisterende LC-MS/MS-analyser utføres modifikasjoner angående kromatografiske forhold, surrogatmatrise og MS/MS-forhold. Spesifikt brukes 5 μM metylenfosfonsyre som mobilfasetilsetning, som tydelig fremmer signalintensiteten og toppformen. Gitt den relativt rene og enkle naturen til nerveprøver og deres lille størrelse, testes ultrapure vann som en erstatningsmatrise. I stedet for hydrofil interaksjonsvæskekromatografikolonne og hypercarb-kolonne, brukes Waters Atlantis Premier BEH C18 AX-kolonnen, hvis unike MaxPeak HPS høyytelses overflateteknologi (passiverer kolonnens indre vegg, eliminerer metalloverflate) muliggjør høy reproduserbarhet, toppsymmetri og baseline-separasjon av alle analytter.I tillegg optimaliseres MS-forholdene for å minimere NAD+-interferenssignalet i kanalen for syklisk adenosindifosfatribose (cADPR) samtidig som responsen til cADPR og nikotinamidmononukleotid (NMN) opprettholdes, med 4000V for ionspray-spenning, 450℃ for turbo-varmer-temperatur, 50 psi for gass 1, 50 psi for gass 2, 30 psi for curtain-gass og 12 psi for kollisjonsgass.
Representativt kromatogram av nerveprøver (normal vs skadet)
Alle fem analytter oppnår baseline-separasjon, der cADPR er en sensitiv biomarkør i nevrodegenerasjonsmodellen. Her induserer isjiasnervaksotomi aksonal degenerasjon, noe som fører til redusert NAD+-nivå og forhøyet NMN-nivå i de skadede nervene, noe som resulterer i omtrent en 2-dobling i NMN/NAD+-forholdet. Samtidig reduseres nivåene av nikotinamid (NAM) og adenosindifosfatribose (ADPR) med omtrent 2 ganger, mens cADPR-nivået økes med mer enn 8 ganger. Disse resultatene er i samsvar med tidligere rapportert forskning, noe som bekrefter nøyaktigheten til denne modifiserte LC-MS/MS-metoden for kvantifisering av NAD+ og dets metabolitter.
Konklusjon
Denne modifiserte LC-MS/MS-metoden muliggjør effektiv baseline-separasjon av NAD+, NMN, NAM, ADPR og cADPR innenfor en kort kjøretid på 5 min, noe som bidrar til tidlig diagnose av ulike nevrologiske lidelser og medikamentutvikling for aldring og nevrodegenerative sykdommer.Referanse
Ma Y, Deng L, Du Z. Utvikling og validering av en LC-MS/MS-metode for kvantifisering av NAD+ og relaterte metabolitter i mus-isjiasnerver og dens anvendelse på en dyremodell for nerveskade. J Chromatogr A. doi:10.1016/j.chroma.2024.464821BONTAC NAD
BONTAChar vært dedikert til forskning og utvikling, produksjon og salg av råmaterialer for koenzymer og naturlige produkter siden 2012, med egne fabrikker, over 170 globale patenter samt et sterkt FoU-team. BONTAC har rik FoU-erfaring og avansert teknologi innen biosyntese avNAD og dets forløpere(f.eks. NMN og NR). Det finnes ulike typer NAD å velge mellom, inkludert NAD ER Grade (endoksinfjerning), NAD Grade I (IVD/kosttilskudd/kosmetikk råpulver), NAD Grade II (API/mellomprodukter) og NAD Grade IV (hvis det er høyere krav til løselighet), som kan leveres i form av frysetørket pulver eller krystallinsk pulver. Renheten til BONTAC NAD kan nå over 98%.
