Vekstkoblet enzymingeniørkunst gjennom manipulering av redoks-kofaktorregenerering

Et stadig bredere utvalg av kjemikalier produseres nå fra fornybare råvarer gjennom bioteknologiske metoder. Bioprosesser er sterkt avhengige av enzymatisk katalyse for effektiv produksjon av disse forbindelsene. Å sikre at enzymer fungerer optimalt i det nødvendige miljøet er derfor av stor interesse for bærekraftig produksjon.

Egenskaper som substratspesifisitet, katalytisk hastighet og (termo)stabilitet er blant flere kritiske faktorer som må optimaliseres for effektive enzymdrevne bioprosesser. Denne optimaliseringen kan være tidkrevende, kostbar og utfordrende, og derfor effektive og kostnadseffektive metoder for vekstkoblet seleksjon; ingeniørenzymer med ønskede egenskaper er svært ettertraktet.

Fordelene med å bruke vekstkoblet seleksjon som en form for enzymseleksjon, som innebærer å koble enzymets aktivitet til cellens vekst. Denne metoden kan brukes som en høygjennomstrømningsseleksjonsstrategi, og kan oppnås enten ved å sikre at veksten er avhengig av produktsyntese fra målenzymet, eller ved å koble enzymets aktivitet til cellens globale energitilstand. Syntetisk biologi kan brukes til å konstruere stammer som egner seg for vekstkoblet seleksjon, og nyere fremskritt har fokusert på å konstruere stammer som mangler oksiderte eller reduserte tilstander av redokskofaktorpar, som kan fungere som enzymingeniørplattformer. Bruken av disse plattformene kan akselerere utviklingen av forbedrede biokatalysatorer og bioprosesser.

Fordeler med vekstkobling via kofaktor-auxotrofi

Fordelene ved å bruke kofaktor-auxotrofi som en seleksjonsmetode for å manipulere enzymer involvert i biosyntesen av visse kjemikalier, som lipider, biodrivstoff, gasser, organiske løsemidler eller polymerforbindelser. Denne tilnærmingen gir flere unike fordeler, inkludert muligheten til å velge ønsket produkt uavhengig av substratet eller produktet av interesse, noe som gjør det enklere å oppdage forbedret enzymatisk aktivitet, og tilbyr en avlesning for å oppdage forbedret enzymatisk aktivitet. I tillegg er bruken av kofaktor-auxotrofer som vekstkoblingsplattformer fordelaktig fordi den allestedsnærværende naturen til redoks-kofaktorer i mikrobiell metabolisme gjør at ingeniørstrategier kan overføres lateralt til andre mikrober av interesse, og enzymer kan konstrueres direkte innenfor miljøet til den ønskede mikrobielle verten. (vist som figur 1)

Figur 1: Sammenligning av flere mye brukte screening-/seleksjonsteknikker for enzymingeniørkunst

Mutanter som mangler NADH-oksidasjon

Oksidasjonen av NADH i E. coli kan skje gjennom to ruter, avhengig av oksygentilgjengelighet. Under aerobe forhold oksideres NADH hovedsakelig gjennom respirasjon for å danne ATP, mens det under anaerobe forhold kan oksideres gjennom fermenteringsveier for å produsere laktat og etanol. Mutante stammer av E. coli, som ikke kan bruke blandede fermenteringsveier for NADH-oksidasjon under anaerob vekst, har blitt brukt til å drive NADH-oksidasjonsveier for anaerob syntese av ulike kjemikalier, som 2-metylpropan-1-ol, 2,3-butanediol, 1-butanol og L-alanin. Disse mutante stammene har også blitt brukt til å konstruere enzymer ved å utnytte lignende redoksprinsipper, noe som har resultert i forbedrede varianter. De resulterende stammene kan brukes til å konstruere andre NAD(P)H-avhengige enzymer og veier.

Mutanter som mangler NAD+-reduksjon  

Wenk et al. skapte en E. coli-stamme ved å slette dihydrolipoyldehydrogenase (lpd)-genet, noe som resulterte i at stammen ikke klarte å generere reduksjonskraft (NADH og NADPH) fra acetatmetabolismen på grunn av fravær av pyruvatdehydrogenaseaktivitet. Dette førte til at stammen viste auxotrofi for å redusere kraften når den ble dyrket aerobt på acetat som eneste karbonkilde. (vist som figur 2) Stammen kunne vokse på acetat når den ble supplert med øvre glykolytiske substrater eller når den uttrykkte NAD+-avhengige formate-, etanol- eller metanoldehydrogenaser med deres respektive substrater. Stammen ble ikke brukt til enzymteknikk og ble kun vurdert for redokskofaktor-auxotrofi.
 

Figur 2: Sentral metabolisme 

Mutanter som mangler NADPH-oksidasjon

Det finnes to ulike strategier for å indusere NADP+ auxotrofi i E. coli, basert på å konstruere den glykolytiske veien for å overprodusere NADPH. Den første strategien innebærer å slette det opprinnelige gapA-genet og uttrykke et heterologt NADP+-avhengig GAPDH-enzym, mens den andre strategien innebærer å omdirigere karbonfluksen gjennom pentosefosfatveien. De resulterende stammene kan ikke vokse på glukose, men viser vekst under andre forhold, hvor den første stammen dyrkes under anaerobe forhold og den andre under aerobe forhold med glyserol som substrat. Disse stammene brukes til å konstruere enzymer med forbedrede egenskaper, inkludert substratspesifisitet, katalytisk aktivitet og termostabilitet.

Mutanter som mangler NADP+-reduksjon

Tre forskjellige bakterier, E. coli, P. putida og C. glutamicum, er konstruert for å være NADPH-auxotrofe, noe som betyr at de krever eksogen NADPH for vekst. I tilfellet E. coli og C. glutamicum ble sentrale metabolske enzymer slått ut for å unngå NADP+-reduksjon når glukose ble levert som karbonkilde, mens i P. putida ble CRISPR/nCas9-assistert ingeniørkunst brukt til å forstyrre sett av målgener sekvensielt for å forstå deres involvering i redoksmetabolismen. NADPH-auxotrofe stammer ble deretter brukt til vekstkoblet enzymteknikk basert på kofaktorspesifisitet. En enkelt runde med mutagenese med E. coli ga den mest effektive og spesifikke NADP+-avhengige formiadehydrogenasen til dags dato, mens P. putida og C. glutamicum representerer de første stammene av sin art som kan brukes til denne typen ingeniørkunst.

Mutanter som mangler NMN+-reduksjon

Et vekstkoblet seleksjonssystem ble utviklet for å koble kofaktorsyklus og vekst basert på mangel i NMN+-reduksjon. E. coli SHuffle-stammen ble brukt, som bærer delesjoner i to gener involvert i produksjonen av redusert glutation. En NMNH-avhengig glutathionreduktase ble utviklet gjennom rasjonell mutagenese for å knytte prosessen til NMN+/NMNH-sykling, og en NMN+-avhengig glukosedehydrogenase ble brukt for å støtte NMN+/NMNH-kofaktorsyklus og dermed vekst. Studien anvendte også ikke-kanonisk redokskofaktor-auxotrofi for vekstkoblet enzymteknikk for første gang, noe som resulterte i en termostabil fosfitdehydrogenasevariant med forbedret katalytisk effektivitet og tidsstabilitet in vitro. Arbeidet gir en nyttig stamme for vekstkoblet enzym-ingeniørkunst, avhengig av NMN+/NMNH-syklus og auxotrof for den reduserte tilstanden til en ikke-kanonisk redoks-kofaktor.

Potensialet for vekstkobling via redoks-kofaktorer fungerte som et kraftig verktøy for å konstruere biokatalysatorer, spesielt i konteksten av bærekraftig bioproduksjon. Selv om det er gjort betydelige fremskritt i genereringen av redoks kofaktor-auxotrofe stammer, antyder uttalelsen at det fortsatt finnes flere uutforskede forskningsveier. En av disse innebærer å konstruere kofaktor-auxotrofe stammer av organismer andre enn E. coli, noe som kan åpne nye muligheter for vekstkoblet enzym-ingeniørkunst.

Alt i alt antyder det at bruken av redoks-kofaktorbasert vekst-kobling representerer en stor mulighet for ingeniørbasert biokatalyse, særlig for produksjon av produkter som ikke kan tilfredsstille kravene til andre høygjennomstrømningsenzymteknikker. Den understreker behovet for å utvikle mer allsidige og effektive biokatalysatorer for bærekraftig bioproduksjon og understreker viktigheten av fortsatt forskning på dette området.


Referanse: Jochem R. Nielsen a, Ruud A. Weusthuis b, Wei E. Huang a, Vekstkoblet enzymingeniørkunst gjennom manipulering av redoks-kofaktorregenerering, Biotechnology Advances, 2023.